MECANISMOS DE TRANSFERENCIA HORIZONTAL DE MATERIAL GENÉTICO EN BACTERIAS
Conjugación
Transducción
Transformación
BACTERIAS NATURALMENTE COMPETENTES
Aquellas que son capaces de introducir ADN desnudo a su citoplasma
Hasta 2014, alrededor de 82 especies naturalmente competentes:
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumonie
Bacillus subtilis
Haemophilus influenzae
Neisseria gonorrhoeae
Helicobacter pylori, etc.
(Johnston et al., 2014; Snyder et al., 2013)
COMPROBAR LA PUREZA DEL MATERIAL GENÉTICO A INTRODUCIR: PLASMIDO pBABE-GFP)
5169 bp, codifica para resistencia ampicilina AmpR y producción de proteína verde fluorescente.
ELECTROFORESIS EN GEL: SEPARACIÓN DE BIOMOLÉCULAS
Distintas moléculas tendrán una velocidad electroforética distinta, asociada a su peso y a la carga que presente en las condiciones fijadas por el buffer, que al interaccionar con la superficie porosa del gel promoverá su separación
EL BUFFER DE CARGA/COLORANTE DE CARGA= GLICEROL+COLORANTE
Se mezcla con la muestra.
Sus funciones son:
Proporciona mayor densidad que le permita migrar dentro del gel
Observar el avance de la electroforesis mediante un colorante
REVELADO DEL GEL
INTERPRETACIÓN DE BANDAS
TRANSFORMACIÓN ARTIFICIAL: OBTENCIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES
PROCEDIMIENTO DE ELECTROPORACIÓN
CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS
EFICIENCIA DE LA TRANSFORMACIÓN: CONCENTRACIÓN INICIAL
Trazo de Curva de McFarland
Cálculo de limite de detección (X+3σ)
Medir la D.O a 600 nm y determinar la turbidez del cultivo (0.605 ).
Determinar la concentración del cultivo.
Convertir de D.O a UK (Dividir entre 0.02)
Interpolar la concentración de E.coli/mL
EFICIENCIA DE LA TRANSFORMACIÓN: CONCENTRACIÓN DE COLONIAS TRANSFORMANTES
Cuenta en placa de agar luria+ampicilina Verdes y fluorescentes al UV.
Determinar concentración de colonias transformantes tomando en cuenta el volumen de inoculación (500 µL).
EFICIENCIA DE LA TRANSFORMACIÓN: CONCENTRACIÓN DEL PLÁSMIDO AGREGADO
La absorbancia de la muestra de DNA se determina en el espectrofotómetro a 260 nm (ácidos nucleicos, 280 nm (proteína) y 230 nm (guanidina y otros solubles en fenol).
Para esta caso D.O 260 nm=1.35
Multiplicar el valor de absorbancia por el factor de conversión considerando que una unidad de absorbancia a 260nm= 50µg ADN/mL. Debe considerarse la dilución realizada para la medición en caso de ser requerida (1:5, 1:10, etc).
UTILIDAD DE LA TRANSFORMACIÓN: PROTEÍNAS/ENZIMAS RECOMBINANTES
PROYECTO-INFORME
CURVA DE MC FARLAND DE REFERENCIA PARA TODOS LOS CASOS
Obtén la función que te permita relacionar la turbidez en función de la concentración microbiana (microorganismos/mL).
Calcula el valor del límite de detección si el valor de los blancos independientes fue de B1=10, B2=11,B3=20, B4=0, B5=2 UK
EQUIPO 1
Se realizó el procedimiento para la extracción y purificación del ADN plasmídico del pBABE-GFP a partir de una cepa de Salmonella typhimurium ampR gfp+.
Como el analista es inexperto en el área realizó 4 veces el procedimiento.
Indica en cual de ellos tuvo éxito el analista y argumenta.
Dí el peso de cada uno de los fragmentos de DNA extraídos.
ELECTROTRANSFORMACIÓN
Se realizó la electrotransformación de Escherichia coli para introducirle el plásmido pBABE-GFP.
Para obtener las células electrocompetentes se utilizó un cultivo con una DO600 nm= 0.668
Se inocularon 500 µL del cultivo recuperado ( en 1000 µL de medio SOC) después del procedimiento y se sembraron en Agar Luria+ampicilina y se obtuvieron 10 UFC verdes fluorescentes.
El plásmido purificado tuvo una D.O 260nm= 0.95, del cual se agregó 1µL.
Determina la eficiencia de la transformación.
Indica los resultados que se observarían en las pruebas IMViC y en agar Kligler.
EQUIPO 2
Se realizó el procedimiento para la extracción y purificación del ADN plasmídico del pBABE-GFP a partir de una cepa de Salmonella typhimurium ampR gfp+.
Como el analista es inexperto en el área realizó 3 veces el procedimiento.
Indica en cual de ellos tuvo éxito el analista y argumenta.
Dí el peso de cada uno de los fragmentos de DNA extraídos.
ELECTROTRANSFORMACIÓN
Se realizó la electrotransformación de Escherichia coli para introducirle el plásmido pBABE-GFP.
Para obtener las células electrocompetentes se utilizó un cultivo con una DO600 nm= 0.56
Se inocularon 500 µL del cultivo recuperado ( en 1000 µL de medio SOC) después del procedimiento y se sembraron en Agar Luria+ampicilina y se obtuvieron 22 UFC verdes fluorescentes.
El plásmido purificado tuvo una D.O 260nm= 1.2 , del cual se agregaron 1.5 µL.
Determina la eficiencia de la transformación.
Indica los resultados que se observarían en las pruebas IMViC y en agar Kligler.
EQUIPO 3
Se realizó el procedimiento para la extracción y purificación del ADN plasmídico del pBABE-GFP a partir de una cepa de Salmonella typhimurium ampR gfp+.
Como el analista es inexperto en el área realizó 3 veces el procedimiento.
Indica en cual de ellos tuvo éxito el analista y argumenta.
Dí el peso de cada uno de los fragmentos de DNA extraídos.
ELECTROTRANSFORMACIÓN
Se realizó la electrotransformación de Escherichia coli para introducirle el plásmido pBABE-GFP.
Para obtener las células electrocompetentes se utilizó un cultivo con una DO600 nm= 0.63
Se inocularon 500 µL del cultivo recuperado ( en 1000 µL de medio SOC) después del procedimiento y se sembraron en Agar Luria+ampicilina y se obtuvieron 58 UFC verdes fluorescentes.
El plásmido purificado tuvo una D.O 260nm= 1.34, del cual se agregaron 0.5 µL.
Determina la eficiencia de la transformación.
Indica los resultados que se observarían en las pruebas IMViC y en agar Kligler.
EQUIPO 4
Se realizó el procedimiento para la extracción y purificación del ADN plasmídico del pBABE-GFP a partir de una cepa de Salmonella typhimurium ampR gfp+.
Como el analista es inexperto en el área realizó 4 veces el procedimiento.
Indica en cual de ellos tuvo éxito el analista y argumenta.
Dí el peso de cada uno de los fragmentos de DNA extraídos.
ELECTROTRANSFORMACIÓN
Se realizó la electrotransformación de Escherichia coli para introducirle el plásmido pBABE-GFP.
Para obtener las células electrocompetentes se utilizó un cultivo con una DO600 nm= 0.54
Se inocularon 500 µL del cultivo recuperado ( en 1000 µL de medio SOC) después del procedimiento y se sembraron en Agar Luria+ampicilina y se obtuvieron 25 UFC verdes fluorescentes.
El plásmido purificado tuvo una D.O 260nm= 1.62 del cual se agregaron 1.5 µL.
Determina la eficiencia de la transformación.
Indica los resultados que se observarían en las pruebas IMViC y en agar Kligler.
EQUIPO 5
Se realizó el procedimiento para la extracción y purificación del ADN plasmídico del pBABE-GFP a partir de una cepa de Salmonella typhimurium ampR gfp+.
Como el analista es inexperto en el área realizó 4 veces el procedimiento.
Indica en cual de ellos tuvo éxito el analista y argumenta.
Dí el peso de cada uno de los fragmentos de DNA extraídos.
ELECTROTRANSFORMACIÓN
Se realizó la electrotransformación de Escherichia coli para introducirle el plásmido pBABE-GFP.
Para obtener las células electrocompetentes se utilizó un cultivo con una DO600 nm= 0.68
Se inocularon 500 µL del cultivo recuperado ( en 1000 µL de medio SOC) después del procedimiento y se sembraron en Agar Luria+ampicilina y se obtuvieron 132 UFC verdes fluorescentes.
El plásmido purificado tuvo una D.O 260nm= 1.78, del cual se agregaron 2 µL.
Determina la eficiencia de la transformación.
Indica los resultados que se observarían en las pruebas IMViC y en agar Kligler.
EQUIPO 6
Se realizó el procedimiento para la extracción y purificación del ADN plasmídico del pBABE-GFP a partir de una cepa de Salmonella typhimurium ampR gfp+.
Como el analista es inexperto en el área realizó 6 veces el procedimiento.
Indica en cual de ellos tuvo éxito el analista y argumenta.
Dí el peso de cada uno de los fragmentos de DNA extraídos.
ELECTROTRANSFORMACIÓN
Se realizó la electrotransformación de Escherichia coli para introducirle el plásmido pBABE-GFP.
Para obtener las células electrocompetentes se utilizó un cultivo con una DO600 nm= 0.70
Se inocularon 500 µL del cultivo recuperado ( en 1000 µL de medio SOC) después del procedimiento y se sembraron en Agar Luria+ampicilina y se obtuvieron 12 UFC verdes fluorescentes.
El plásmido purificado tuvo una D.O 260nm= 1.90, del cual se agregaron 0.5 µL.
Determina la eficiencia de la transformación.
Indica los resultados que se observarían en las pruebas IMViC y en agar Kligler.
EQUIPO 7
Se realizó el procedimiento para la extracción y purificación del ADN plasmídico del pBABE-GFP a partir de una cepa de Salmonella typhimurium ampR gfp+.
Como el analista es inexperto en el área realizó 4 veces el procedimiento.
Indica en cual de ellos tuvo éxito el analista y argumenta.
Dí el peso de cada uno de los fragmentos de DNA extraídos.
ELECTROTRANSFORMACIÓN
Se realizó la electrotransformación de Escherichia coli para introducirle el plásmido pBABE-GFP.
Para obtener las células electrocompetentes se utilizó un cultivo con una DO600 nm= 0.60
Se inocularon 500 µL del cultivo recuperado ( en 1000 µL de medio SOC) después del procedimiento y se sembraron en Agar Luria+ampicilina y se obtuvieron 178 UFC verdes fluorescentes.
El plásmido purificado tuvo una D.O 260nm= 1.75, del cual se agregaron 2 µL.
Determina la eficiencia de la transformación.
Indica los resultados que se observarían en las pruebas IMViC y en agar Kligler.
MATERIAL DE APOYO
Obtención de células competentes: transformación artificial, fundamento
