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GENÉTICA BACTERIANA: TRANSFORMACIÓN

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• Conjugación
• Transducción 
• Transformación 

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• Aquellas que son capaces de introducir ADN desnudo a su citoplasma
• Hasta 2014, alrededor de 82 especies naturalmente competentes:
  • Staphylococcus aureus
  • Streptococcus pneumonie
  • Bacillus subtilis
  • Haemophilus influenzae
  • Neisseria gonorrhoeae
  • Helicobacter pylori, etc.
  • (Johnston et al., 2014; Snyder et al., 2013)

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• 5169 bp, codifica para resistencia ampicilina AmpR y producción de proteína verde fluorescente.

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• Distintas moléculas tendrán una velocidad electroforética distinta, asociada a su peso y a la carga que presente en las condiciones fijadas por el buffer, que al interaccionar con la superficie porosa del gel promoverá su separación

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• Se mezcla con la muestra.
• Sus funciones son:
  • Proporciona mayor densidad que le permita migrar dentro del gel
  • Observar el avance de la electroforesis mediante un colorante

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REVELADO DEL GEL

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INTERPRETACIÓN DE BANDAS

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TRANSFORMACIÓN ARTIFICIAL: OBTENCIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES

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PROCEDIMIENTO DE ELECTROPORACIÓN

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CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS 

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• Trazo de Curva de McFarland

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• Cálculo de limite de detección (X+3σ)

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• Medir la D.O a 600 nm y determinar la turbidez del cultivo (0.605 ).

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• Determinar la concentración del cultivo. 
  • Convertir de D.O a UK (Dividir entre 0.02)

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• Interpolar la concentración de E.coli/mL

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• Cuenta en placa de agar luria+ampicilina Verdes y fluorescentes al UV.

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• Determinar concentración de colonias transformantes tomando en cuenta el volumen de inoculación (500 µL).

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• La absorbancia de la muestra de DNA se determina en el espectrofotómetro a 260 nm (ácidos nucleicos, 280 nm (proteína) y 230 nm (guanidina y otros solubles en fenol).

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• Para esta caso D.O 260 nm=1.35

• Multiplicar el valor de absorbancia por el factor de conversión considerando que una unidad de absorbancia a 260nm= 50µg ADN/mL. Debe considerarse la dilución realizada para la medición en caso de ser requerida (1:5, 1:10, etc).

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UTILIDAD DE LA TRANSFORMACIÓN: PROTEÍNAS/ENZIMAS RECOMBINANTES

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• Obtén la función que te permita relacionar la turbidez en función de la concentración microbiana (microorganismos/mL).
• Calcula el valor del límite de detección si el valor de los blancos independientes fue de B1=10, B2=11,B3=20, B4=0, B5=2 UK

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• Se realizó el procedimiento para la extracción y purificación del ADN plasmídico del pBABE-GFP a partir de una cepa de Salmonella typhimurium ampR gfp+.
• Como el analista es inexperto en el área realizó 4 veces el procedimiento. 
• Indica en cual de ellos tuvo éxito el analista y argumenta. 
• Dí el peso de cada uno de los fragmentos de DNA extraídos.

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• Se realizó la electrotransformación de Escherichia coli para introducirle el plásmido pBABE-GFP.
• Para obtener las células electrocompetentes se utilizó un cultivo con una DO600 nm= 0.668
• Se inocularon 500 µL del cultivo recuperado ( en 1000 µL de medio SOC) después del procedimiento y se sembraron en Agar Luria+ampicilina y se obtuvieron 10 UFC verdes fluorescentes.
• El plásmido purificado tuvo una D.O 260nm= 0.95, del cual se agregó 1µL.
• Determina la eficiencia de la transformación.
• Indica los resultados que se observarían en las pruebas IMViC y en agar Kligler.

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• Se realizó el procedimiento para la extracción y purificación del ADN plasmídico del pBABE-GFP a partir de una cepa de Salmonella typhimurium ampR gfp+.
• Como el analista es inexperto en el área realizó 3 veces el procedimiento. 
• Indica en cual de ellos tuvo éxito el analista y argumenta. 
• Dí el peso de cada uno de los fragmentos de DNA extraídos.

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• Se realizó la electrotransformación de Escherichia coli para introducirle el plásmido pBABE-GFP.
• Para obtener las células electrocompetentes se utilizó un cultivo con una DO600 nm= 0.56
• Se inocularon 500 µL del cultivo recuperado ( en 1000 µL de medio SOC) después del procedimiento y se sembraron en Agar Luria+ampicilina y se obtuvieron 22 UFC verdes fluorescentes.
• El plásmido purificado tuvo una D.O 260nm= 1.2 , del cual se agregaron 1.5 µL.
• Determina la eficiencia de la transformación.
• Indica los resultados que se observarían en las pruebas IMViC y en agar Kligler.

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• Se realizó el procedimiento para la extracción y purificación del ADN plasmídico del pBABE-GFP a partir de una cepa de Salmonella typhimurium ampR gfp+.
• Como el analista es inexperto en el área realizó 3 veces el procedimiento. 
• Indica en cual de ellos tuvo éxito el analista y argumenta. 
• Dí el peso de cada uno de los fragmentos de DNA extraídos.

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ELECTROTRANSFORMACIÓN

• Se realizó la electrotransformación de Escherichia coli para introducirle el plásmido pBABE-GFP.
• Para obtener las células electrocompetentes se utilizó un cultivo con una DO600 nm= 0.63
• Se inocularon 500 µL del cultivo recuperado ( en 1000 µL de medio SOC) después del procedimiento y se sembraron en Agar Luria+ampicilina y se obtuvieron 58 UFC verdes fluorescentes.
• El plásmido purificado tuvo una D.O 260nm= 1.34, del cual se agregaron 0.5 µL.
• Determina la eficiencia de la transformación.
• Indica los resultados que se observarían en las pruebas IMViC y en agar Kligler.

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• Se realizó el procedimiento para la extracción y purificación del ADN plasmídico del pBABE-GFP a partir de una cepa de Salmonella typhimurium ampR gfp+.
• Como el analista es inexperto en el área realizó 4 veces el procedimiento. 
• Indica en cual de ellos tuvo éxito el analista y argumenta. 
• Dí el peso de cada uno de los fragmentos de DNA extraídos.

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• Se realizó la electrotransformación de Escherichia coli para introducirle el plásmido pBABE-GFP.
• Para obtener las células electrocompetentes se utilizó un cultivo con una DO600 nm= 0.54
• Se inocularon 500 µL del cultivo recuperado ( en 1000 µL de medio SOC) después del procedimiento y se sembraron en Agar Luria+ampicilina y se obtuvieron 25 UFC verdes fluorescentes.
• El plásmido purificado tuvo una D.O 260nm= 1.62 del cual se agregaron 1.5 µL.
• Determina la eficiencia de la transformación.
• Indica los resultados que se observarían en las pruebas IMViC y en agar Kligler.

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• Se realizó el procedimiento para la extracción y purificación del ADN plasmídico del pBABE-GFP a partir de una cepa de Salmonella typhimurium ampR gfp+.
• Como el analista es inexperto en el área realizó 4 veces el procedimiento. 
• Indica en cual de ellos tuvo éxito el analista y argumenta. 
• Dí el peso de cada uno de los fragmentos de DNA extraídos.

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• Se realizó la electrotransformación de Escherichia coli para introducirle el plásmido pBABE-GFP.
• Para obtener las células electrocompetentes se utilizó un cultivo con una DO600 nm= 0.68
• Se inocularon 500 µL del cultivo recuperado ( en 1000 µL de medio SOC) después del procedimiento y se sembraron en Agar Luria+ampicilina y se obtuvieron 132 UFC verdes fluorescentes.
• El plásmido purificado tuvo una D.O 260nm= 1.78, del cual se agregaron 2 µL.
• Determina la eficiencia de la transformación.
• Indica los resultados que se observarían en las pruebas IMViC y en agar Kligler.

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• Se realizó el procedimiento para la extracción y purificación del ADN plasmídico del pBABE-GFP a partir de una cepa de Salmonella typhimurium ampR gfp+.
• Como el analista es inexperto en el área realizó 6 veces el procedimiento. 
• Indica en cual de ellos tuvo éxito el analista y argumenta. 
• Dí el peso de cada uno de los fragmentos de DNA extraídos.

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ELECTROTRANSFORMACIÓN

• Se realizó la electrotransformación de Escherichia coli para introducirle el plásmido pBABE-GFP.
• Para obtener las células electrocompetentes se utilizó un cultivo con una DO600 nm= 0.70
• Se inocularon 500 µL del cultivo recuperado ( en 1000 µL de medio SOC) después del procedimiento y se sembraron en Agar Luria+ampicilina y se obtuvieron 12 UFC verdes fluorescentes.
• El plásmido purificado tuvo una D.O 260nm= 1.90, del cual se agregaron 0.5 µL.
• Determina la eficiencia de la transformación.
• Indica los resultados que se observarían en las pruebas IMViC y en agar Kligler.

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• Se realizó el procedimiento para la extracción y purificación del ADN plasmídico del pBABE-GFP a partir de una cepa de Salmonella typhimurium ampR gfp+.
• Como el analista es inexperto en el área realizó 4 veces el procedimiento. 
• Indica en cual de ellos tuvo éxito el analista y argumenta. 
• Dí el peso de cada uno de los fragmentos de DNA extraídos.

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• Se realizó la electrotransformación de Escherichia coli para introducirle el plásmido pBABE-GFP.
• Para obtener las células electrocompetentes se utilizó un cultivo con una DO600 nm= 0.60
• Se inocularon 500 µL del cultivo recuperado ( en 1000 µL de medio SOC) después del procedimiento y se sembraron en Agar Luria+ampicilina y se obtuvieron 178 UFC verdes fluorescentes.
• El plásmido purificado tuvo una D.O 260nm= 1.75, del cual se agregaron 2 µL.
• Determina la eficiencia de la transformación.
• Indica los resultados que se observarían en las pruebas IMViC y en agar Kligler.

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• Obtención de células competentes: transformación artificial, fundamento

https://www.youtube.com/watch?v=7Ul9RVYG5CM

• Electrotransformación de E. coli-Procedimiento

https://www.youtube.com/watch?v=-z9yiCu2JjM&feature=youtu.be 

• Electroporación distintos equipos

https://www.youtube.com/watch?v=ulA8xsVji80 

https://www.youtube.com/watch?v=dHMVEQ8Zmlo 

• Fundamento de electroforesis

https://www.youtube.com/watch?v=R3xBMqLKL5M 

• Electroforesis en gel de agarosa 

https://www.youtube.com/watch?v=U1g2qt3juZw 

https://www.youtube.com/watch?v=NL1usCc0n38&t=186s 

I Unidad Didáctica

• DIAZ, R y Colab. 2003. Manual Práctico de Microbiología, 2da Edic.; Edit.; Masson.
• GRANADOS,P. RAQUEL Y VILLAVERDE, P. CARNEN. 2003. Microbiología, tomo I 1era Edic.; Edit.; Thoson
• KONEMAN W. Allen 2006 Diagnostico microbiológico. 6ta. Ed. Editorial medica panamericana S.A.
• http://www.icmsf.iit.edu/
• http://www.fda.gov/
• http://www.aoac.org/

II Unidad Didáctica

• ALBERT, C. ESCOLA, M. 2002. Método de análisis microbiológico. Madrid. Ediciones Diaz de Santos S.A.
• GAMAZO, C. y Colb. 2005. Manual Práctico de Microbiología. 3era edic.; Edit.; Massot.
• GRANADOS, P. RAQUEL Y VILLAVERDE, P. CARMEN. 2007. icrobiología, tomo II, 2da Edic.; Edit.; Thoson.
• http://www. Infocame.com /
• http://www. minsa.gob.pe /
• http://www. conam.gob.pe /

III Unidad Didáctica

• GARCIA, de microbiologia médica. Mexico
• LEVINSON, w. 2004. Microbiología e inmunología médica, 8 edic.; Edit.; Interamericana.
• LEVEAU, J, y BOUIX, M, 2000. Microbiología, 1era Edic. ; Edit. ; Acribía. 
• http://vm.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-toc.html
• http://www.codexalimentarius.net/web/index_es
•  http://www.apha.org

IV Unidad Didáctica

• MURRAY, R. P. Y Colb. 2007. Microbiología. 5ta Edic.; Edit.; Elsevier - España.
• JAWETZ, M Y ADELBERG. 2001, Microbiología médica de Jawetz, 17 ava edic.; Edit.; Manual Moderno.
• STUART, W. T. 2001, Microbiología. 1edic.; Edit.; Interamericana.
• http://www..fao.org/
• http://www.Infoagro.com /
• http://www..diba.es/