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MATERIAL GENERAL EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA.
- 1.-Placas Petri con medio de cultivo sólido.
- 2.- Tubos de ensayo con medio de cultivo líquido.
- 3.- Tubos de ensayo con medio de cultivo sólido inclinado.
- 4.-Matraz para turbidimetria.
- 5.- Mechero Bunsen.
- 6.- Pipetas.
- 7.-Microplacas.
- 8.- Asas de siembra.
- 9.- Asa de Digralsky.
- 10.- Micropipeta automática.
- 11.- Pipeteador manual.
- 12.- Puntas de pipeta automática.
- 13.- Placas Petri.
- 14.- Jarra de anaerobios.
- 15.- Placas de contacto Rodac.
- 16.- Lámina para análisis de superficies.
L-1.- PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO.
Los métodos de esterilización más utilizados son:
- Flameado: Se emplea para esterilizar agujas, asas de siembra, pipetas, cuellos de tubos y matraces, etc. Consiste en someter directamente a la acción de la llama de un mechero los utensilios que se vayan a esterilizar.
Se esteriliza en horno Pasteur, a 180oC durante 2 horas.
- Calor seco: Se usa para esterilizar material de vidrio debidamente preparado. Las placas Petri de vidrio se envuelven juntas en papel manila.Tubos de ensayo, probetas y matraces Erlenmeyer se taponan con algodón graso. Las pipetas se envuelven en papel manila después de colocar en la boquilla un trocito de algodón, que actúa como filtro impidiendo la contaminación del material absorbido con los microorganismos del operador y, a la vez, actúa como protector de éste, evitando la llegada del líquido a la boca.
- Calor húmedo: Autoclave. Se emplea para la esterilización de medios de cultivo.
Se pone agua en el fondo hasta cubrir las resistencias. Se introduce el material y se cierra la tapa apretando los tornillos. Se enciende el autoclave y se espera hasta que desprende un chorro de vapor, lo que indica que todo el aire que contenía el autoclave ha sido eliminado. Se cierra la espita y se sigue calentando hasta que el manómetro señale 1 atmósfera, manteniendo esta presión durante 20 minutos.
Pasado este tiempo, se apaga y se deja descender la temperatura hasta que el manómetro marque cero. Se abre la espita y la no salida de vapor indica que la presión interna ha cesado. A continuación se abre el autoclave.
- Filtración: Se emplea para esterilizar sustancias sensibles al calor
L-3.- OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS.
La observación de los microorganismos se raliza con el microscopio óptico.
L-3.1.- OBSERVACIÓN EN FRESCO
1.- Depositar una gota de agua en un porta y con el asa de siembra esteril tomar una muestra del tubo con el microorganismo.
2.- Mezclar las bacterias con el agua sin extender la muestra. Colocar un cubreobjetos encima de la suspensión bacteriana y observar al microscopio, anotando la forma de la bacteria y si presenta movilidad
L.3.2.- OBSERVACIÓN CON TINCIONES
- Tinción simple: se emplea un solo colorante.
- Tinción diferencial: se emplea más de un colorante y se ve el comportamiento de las bacterias frente a ellos.
- Tinción negativa: Lo que se colorea es el medio que rodea a la bacteria permaneciendo ésta sin teñir.
L-3.2.1.- TINCIÓN SIMPLE DE AZUL DE METILENO.
L-3.2.2.- TINCIÓN NEGATIVA.
L-3.2.3.- TINCIÓN DE GRAM
X-3.1.- TINCIÓN DE ESPORAS
X-3.2.- TINCIÓN DE ÁCIDO-ALCOHOL-RESISTENTE.
M.4.1.- TINCIÓN DE CORPÚSCULOS METACROMÁTICOS:
El género Lactobacillus, forma gránulos con características tintoriales diferentes a las del resto del citoplasma que se denominan corpúsculos metacromáticos.
CORPÚSCULOS METACROMÁTICOS
L.2.- RESIEMBRA DE BACTERIAS EN TUBO DE AGAR INCLINADO
M-1.- AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS EN PLACA.
L.4.- ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS.
L.4.1.- RECUENTO ENTEROBACTERIAS LAC+ (COLIFORMES TOTALES)
M.2.- ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS.
M.2.1.- RECUENTO ENTEROBACTERIAS LAC+ (COLIFORMES TOTALES)
M.2.2.- COLIMETRIA CONFIRMATIVA
M.2.2.- COLIMETRIA CONFIRMATIVA
X.1.- ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUA
X.1.1.- COLIMETRIACONFIRMATIVA
X.1.2.- COLIFORMES FECALES
X.1.3.- IDENTIFICACIÓN DE COLIFORMES
Seleccionar una colonia e inocular tubos para las pruebas del IMViC
- I: Producción de Indol (Tubo AP)
- M: Rojo de Metilo (Tubo CG)
- Vi: Voges Proskauer: Producción de acetil metil carbinol (Tubo CL)
- C: Utilización de Citrato (Tubo C)
J.1.- ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUA
I: Indol:
- Técnica: Inocular el problema en un tubo con Agua Peptonada (AP) e incubar a 37ºC durante 24 horas.
- Resultado: Añadir 2 gotas de Xilol (Indol I), agitar el tubo y dejar reposar. Añadir 1 gota de reactivo de Erlich (Indol II), resbalando por las paredes del tubo. La reacción es positiva cuando aparece un anillo rojo en la capa de xilol. La prueba es negativa si aparece el color amarillento del reactivo.
M: Prueba del Rojo de metilo
- Técnica: Inocular el problema en tubos con medio Caldo glucosado (CG) introduciendo el asa de siembra y agitando un poco el medio líquido. Incubar a 37ºC durante 24 horas.
- Resultado: Añadir 2 gotas de Rojo de Metilo y agitar. La prueba es positiva si aparece una coloración roja. La prueba es negativa cuando la coloración es amarillenta.
Vi: Prueba de Voges-Proskauer. Producción de acetil-metil-carbinol:
- Técnica: Inocular el problema en tubos con medio Clark y Lubs (CL), introduciendo el asa de siembra y agitando un poco el medio líquido. Incubar a 37ºC durante 24 horas.
- Resultado: Añadir 2 gotas de "-naftol (VP I)y 2 gotas de KOH al 40% (VP II) y agitar. La prueba es positiva si aparece una coloración rosa salmón. La prueba es negativa cuando la coloración es amarillenta.
C: Citrato.
- Técnica: Con el asa de siembra se toma muestra del problema y se inocula un tubo C por picadura y en estría en la superficie. Incubar a 37ºC durante 24 horas.
- Resultado: Si el microorganismo ha utilizado el citrato, se produce en la superfície del medio una coloración azul. Si no se observa cambio de color en el medio se considera la prueba negativa.
V-1.- ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS.
V-1.1. RESULTADOS DE LAS PRUEBAS IMVIC
- I: Producción de Indol (Tubo AP)
- M: Rojo de Metilo (Tubo CG)
- Vi: Voges Proskauer: Producción de acetil metil carbinol (Tubo CL)
- C: Utilización de Citrato (Tubo C)
- I: Añadir unas gotas de xilol (Indol I), agitar y dejar reposar.
- Añadir unas gotas de reactivo de Erlich (Indol II).
- M: Añadir unas gotas del indicador Rojo de Metilo
- Vi: Añadir unas gotas de α-naftol (VP I) y unas gotas de KOH al 40% (VP II) y agitar.
- C: Ver color del tubo.
AGAR SANGRE
Extracto de corazón y peptonas 20g
NaCl 5g
Agar 15g
Agua destilada 1000ml
Añadir 50-80 ml de sangre de cordero
- α-hemólisis: lisis parcial de los glóbulos rojos, se forma un halo verdoso alrededor de la colonia.
- β-hemólisis: lisis completa de los glóbulos rojos, aparece una zona transparente alrededor de la colonia.
- γ-hemólisis: no actúan sobre los glóbulos rojos, no forman ningún halo.
Es un medio de cultivo general que permite el crecimiento de gran número de microorganismos.
Se emplea para determinar las reacciones de hemólisis
L-3.- AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS MESOFILOS DEL SUELO.
V-3.2.- OBSERVACIÓN DE LAS COLONIAS DE MICROORGANISMOS VIABLES.
V-3.3.- OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LOS HONGOS Y ACTINOMICETOS .
J.2.- AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS MESÓFILOS DEL SUELO.
J.2.1.- DETERMINACIÓN DE U.F.C.
N= C . D-1 . i-1
- N= nº de unidades formadoras de colonias.
- C= nº de colonias por placa.
- D= nº de dilución (10-3, 10-4 ó 10-5).
- i= inóculo (0,2 ml).
J.2.2.-OBSERVACIÓN DE LAS COLONIAS DE MICROORGANISMOS VIABLES.
J.2.3. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA HONGOS Y ACTINOMICETOS PRESENTES EN EL SUELO.
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